论肿道麻】Nature Reviews：中性粒细胞作为肝细胞癌潜在的治疗靶点

目前为止，癌症免疫治疗的主要焦点一直是淋巴细胞。除淋巴细胞外，HCC环境还包括许多其他免疫细胞类型，其中中性粒细胞正在成为HCC发病机制的重要作用者。

越来越多的证据支持中性粒细胞作为某些癌症发展的免疫抑制环境的关键介质，以及肿瘤进展的驱动因素。2022年4月英国纽卡斯尔大学生物科学研究所的研究人员于《Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology》杂志发表了一篇名为“Neutrophils as potential therapeutic targets in hepatocellular carcinoma”的综述，作者对中性粒细胞在HCC发生发展和转移机制中的作用机制，以及靶向中性粒细胞的抗癌疗法进行了系统性概述。

原发性肝癌是全球常见的三大易致死性癌症之一。肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，由于肝细胞癌特殊的免疫微环境以及慢性炎症的病因，使得HCC的进展需要维持免疫逃避，并且HCC肿瘤微环境已被证明具有特别的免疫抑制作用。因此，存在的任何细胞毒性淋巴细胞都会受到抑制。而来自多个免疫细胞谱系的大量白细胞可以参与调节效应淋巴细胞活性，因此目前淋巴细胞以外的免疫细胞是HCC中被逐渐深入研究的主题。

中性粒细胞是血液中一类丰富的白细胞，是抵抗感染和组织损伤的第一道防线。中性粒细胞可在感染过程中发挥抗菌作用，还会在多种肿瘤中发生浸润，具有一定的免疫调控作用。早期研究表明，中性粒细胞在肿瘤微环境（TME）中只是旁观者，其寿命较短。然而，最近越来越多研究证明中性粒细胞在TME中发挥关键作用，其中肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophil,TAN）是较重要的免疫细胞之一，可参与肿瘤生长、浸润及转移过程，对中性粒细胞特性的操纵可能会改变HCC免疫微环境，使其对全身免疫疗法更加敏感。

1.癌症中的中性粒细胞表型  

中性粒细胞由于其多叶核而具有独特的形态，并且可以由细胞表面表达的表型决定,标记物在人类中是CD15+CD16+CD66b+CD14–,在小鼠中是CD11b+Ly6G+。然而，中性粒细胞异质性和肿瘤中不同中性粒细胞亚群的存在直到最近才被认识到。中性粒细胞分类的术语从之前的巨噬细胞文献中可以获得(Cassetta and Pollard, 2018)。中性粒细胞表型详见表1。

1.1 N1和N2型TAN   

初步尝试对肿瘤相关中性粒细胞（TAN）亚群进行分类是基于阻断转化生长因子β（TGFβ）可以改善癌症并导致髓样细胞流入肿瘤这一现象。TGFβ阻断显示通过阻止中性粒细胞从抗肿瘤（N1）极化到促肿瘤（N2）表型来发挥这种抗肿瘤作用。   与N2中性粒细胞相比，N1中性粒细胞对癌细胞具有更强的细胞毒性，并且表达更高水平的炎症趋化因子。

此外，TGFβ显示通过诱导中性粒细胞极化为N2表型来驱动肿瘤进展。N1中性粒细胞具有增加的氧化爆发、增加的吞噬作用、增加的迁移能力，对T细胞没有抑制作用并且对肿瘤细胞具有增加的细胞毒性。N2中性粒细胞对T细胞具有抑制作用，对肿瘤细胞表现出较差的细胞毒性。然而，N1和N2中性粒细胞的表型和功能特征存在相当大的重叠。例如，N1中性粒细胞可以利用活性氧(ROS)来杀死肿瘤，而N2细胞用活性氧抑制T细胞。   

区分N1和N2中性粒细胞群的困难，可能因肿瘤内或肿瘤区域之间中性粒细胞群的异质性造成的。例如，在HCC中，瘤周中性粒细胞具有不同于瘤内中性粒细胞的特征、功能和预后关联可能。但是，当使用批量表型分析方法来分析从肿瘤中分离出来的中性粒细胞表征时，这些区别就消失了。单细胞技术的应用有助于解决混合细胞群的性质；然而，相当大的技术挑战在于从组织中分离中性粒细胞但要同时保持它们的活性并保持其原始状态。   

1.2 PMN-MDSCs.   

多形核髓源性抑制细胞(PMN‑MDSCs)是未成熟的中性粒细胞，具有促肿瘤功能，包括通过免疫抑制、组织重塑和诱导血管生成促进肿瘤进展。由于缺乏特异性标记，这些细胞很难与N2中性粒细胞区分开来。PMN‑MDSCs通过精氨酸酶1、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、吲哚胺2,3‑双加氧酶(IDO)、TGFβ、环氧合酶2(COX2)、前列腺素E2(PGE2)、IL‑10和ROS产生发挥其免疫抑制功能。PMN‑MDSCs通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)、促动蛋白2（也称为蛋白Bv8同源物）和基质金属蛋白酶刺激组织重塑与血管生成。   

癌症能够通过释放细胞因子如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-6来诱导紧急粒细胞生成，这些细胞因子也可能会影响宿主造血系统，使骨髓前体细胞向MDSC分化或使未成熟中性粒细胞具有促肿瘤表型的，从而促进疾病进展。因此，调节髓源细胞分化以抑制这些促肿瘤骨髓细胞群或促进抗肿瘤中性粒细胞的产生，是包括HCC在内的许多癌症的颇有前景的治疗方法。目前，没有分析方法能够区分PMN‑MDSCs和免疫抑制性促肿瘤中性粒细胞。因此，在本综述中的PMN‑MDSCs，指那些具有促肿瘤表型的未成熟中性粒细胞。   

1.3 N1/N2分类相关问题   

单细胞技术已经证明，中性粒细胞表现出相当大的表型异质性，并且它们的表型是高度动态的，且受它们所在的组织、昼夜节律、年龄及其成熟状态的影响。这种理解对目前将癌症中的中性粒细胞分类为N1、N2和PMN‑MDSCs这一分类方法提出了质疑，因为这种分类下细胞的表型应该是固定的。一项大型单细胞研究通过追踪中性粒细胞在骨髓成熟、释放到循环系统和迁移到发炎和非发炎组织的过程中的细胞表型，揭示了中性粒细胞表型存在于一个单一的时间轴上，主要由它们的成熟阶段指导，并且该时间线内的嗜中性粒细胞表型也根据其所在组织进行聚类。这种表型的发育的连续体被本研究的作者称为“中性时间”，是理解和研究中性粒细胞可塑性的有用工具，并且需要在癌症背景下进一步探索。因此，我们建议当前的N1与N2分类方案代表了极端的表型，并且实际上中性粒细胞存在于受其组织环境影响的动态促肿瘤和抗肿瘤状态范围内。   

2. HCC的临床观察研究   

2.1 循环中性粒细胞   

中性粒细胞与淋巴细胞的比值(NLR)升高是广泛接受的HCC患者晚期疾病、预后不良和治疗反应差的标志物。在一项对HCC患者两个大型独立队列（总共1,168名参与者）的研究中，中性粒细胞是唯一与患者预后相关的细胞类型。高中性粒细胞计数与更晚期的疾病、更差的体能状态和较差的总体生存率独立相关。NLR增加和中性粒细胞绝对计数升高也预示预后不良和对HCC治疗反应差（例如肝切除、肝移植、经动脉化疗栓塞和索拉非尼单药治疗）。   

NLR状态还可以预测HCC对免疫治疗的反应。在一项对接受nivolumab单抗治疗的患者进行的小型回顾性研究中，治疗后NLR较低与治疗反应和生存率提高相关。然而，目前我们主张谨慎使用NLR作为HCC患者的预测生物标志物，因为该比率也可以预测无HCC的肝硬化患者的生存率。   

有趣的是，一项研究报导，增加的NLR可预测HCC患者的预后改善。尽管这项研究的结果似乎与大量文献中的结果相矛盾，但并未报道其研究中患者的疾病分期、潜在病因、肝功能和接受的治疗，这可能是这些差异的基础。高NLR也是其他癌症的预后因素，包括肝内胆管癌、结直肠癌、转移性黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、B细胞淋巴瘤和肾细胞癌。  

2.2肿瘤相关中性粒细胞   

大量TAN是HCC和各种其他癌症（如头颈癌、神经胶质瘤、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤和肾细胞癌）预后不良的生物标志物。是肿瘤周围还是肿瘤内TAN，或两者兼而有之，是否解释了这种关联仍不清楚。一些研究报告肿瘤周围中性粒细胞数量与预后不良相关，而其他研究报告肿瘤内中性粒细胞数量与预后不良相关。然而，这些观察性研究的结果应该谨慎解释，因为它们是使用来自以治愈为目的进行肝切除术的HCC患者的组织进行的。在临床实践中，此类患者通常具有早期的局部肝疾病，肝功能普遍保留，而且体能状态良好。在病毒性肝炎患病率低且非酒精性脂肪肝病常见的国家，只有15%的HCC患者在分期时有这种早期疾病，并被认为是治愈性切除的候选者。因此，这些研究中与TAN数相关的观察结果可能不适用于更晚期HCC的个体，因为这些个体占患者的大多数，并且通常考虑接受全身治疗。   

3.中性粒细胞募集和极化   

粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)、嗜中性粒细胞C‑X‑C趋化因子受体4(CXCR4)、CXCR2和C‑X‑C趋化因子配体12(CXCL12)在骨髓基质中严格控制骨髓中性粒细胞的动员。嗜中性粒细胞募集到组织、肿瘤和炎症部位也受趋化因子控制。中性粒细胞表达的主要趋化因子受体是CXCR1和CXCR2，尽管其他趋化因子受体，如CXCR4、CXCR6、C–C趋化因子受体5(CCR5)和CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)也影响中性粒细胞募集。CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL12、CXCL16和CC基序配体5(CCL5)在HCC肿瘤细胞中上调，并促进中性粒细胞募集到肿瘤中。肿瘤基质细胞也可能诱导中性粒细胞募集；CXCL2和CXCL8由肿瘤相关单核细胞分泌并延长中性粒细胞存活时间，从而使肿瘤内中性粒细胞积聚。癌症相关成纤维细胞(CAF)、肝星状细胞(HSC)和肿瘤激活的基质细胞分泌CXCL12。中性粒细胞的积累发生在人类HCC的缺氧区域并由缺氧诱导因子(HIF)诱导缺氧HCC细胞表达CCL26，然后通过CX3CR1诱导中性粒细胞趋化性。   

非趋化因子中性粒细胞引诱剂在中性粒细胞募集中也很重要。S100A8和S100A9是由骨髓细胞和HCC表达的钙结合蛋白，被认为可促进中性粒细胞募集和疾病进展。敲除S100A9的小鼠表现出中性粒细胞募集减少和对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的HCC具有保护作用。此外，S100A9在HCC中的高表达与接受手术切除的患者预后不良有关。S100A8和S100A9通过诱导肝细胞表达CXCL1和CXCL2来招募中性粒细胞，其他疾病模型的研究表明它们也对中性粒细胞粘附和高级聚糖终产物特异性受体(RAGE)信号传导产生影响。

GM‑CSF、IL‑6、TGFβ、PGE2、透明质酸片段和缺氧都驱动HCC中促肿瘤中性粒细胞的极化和积累。GM‑CSF通过PI3K‑AKT、JNK‑ERK‑p38MAPK和NF‑κB信号通路刺激中性粒细胞。GM‑CSF还刺激中性粒细胞释放肝细胞生长因子(HGF)，中性粒细胞本身具有促进转移的作用。HCC细胞、CAF和HSC分泌IL‑6，促进促肿瘤中性粒细胞极化，诱导PDL1的中性粒细胞表面表达并提高中性粒细胞存活率，从而促进中性粒细胞在系统性和肿瘤内的积累。在HCC患者中发现血清GM‑CSF和IL‑6水平升高，并可能推动骨髓或血液中任何中性粒细胞群（包括PMN‑MDSCs）的促肿瘤极化。

HSC产生PGE2，进一步极化促肿瘤中性粒细胞，而肿瘤激活的基质细胞分泌TGFβ，一种已知的原促瘤中性粒细胞表型诱导剂。在肿瘤微环境中，透明质酸碎片和缺氧也可能诱导促肿瘤中性粒细胞。肿瘤细胞产生的透明质酸片段可以激活促肿瘤中性粒细胞，从而通过与Toll样受体4(TLR4)的相互作用以及随后诱导PI3K‑AKT信号传导来延长它们的存活时间。缺氧诱导ENTPD2基因（编码外核苷酸三磷酸二磷酸水解酶2）的过表达和肿瘤细胞产生5‑AMP，从而促进肿瘤微环境中促肿瘤中性粒细胞的积累。图1总结了TAN募集和诱导促肿瘤表型的主要机制。  

图1.肝细胞癌中中性粒细胞肿瘤的募集和极化   

中性粒细胞募集到肿瘤中并极化为促肿瘤表型是使中性粒细胞能够驱动肿瘤进展的关键步骤。中性粒细胞是否首先在循环中经历极化为促肿瘤表型，然后被募集到肿瘤中，还是相反的，先被募集到肿瘤中然后极化成促肿瘤表型仍不清楚。在癌症患者和临床前癌症模型中均观察到具有促肿瘤表型的循环中性粒细胞积累。然而，这些中性粒细胞经历极化的位置不一定在循环中，因为在非癌症模型中获得的证据表明，中性粒细胞可以从炎症部位反向迁移并回到体循环。因此，循环中的促肿瘤中性粒细胞可能在肿瘤微环境中被极化，然后经历反向迁移。需要进一步详细研究比较肿瘤和全身中性粒细胞的表型和功能特征以及体内成像研究，以解决HCC中的这一重要问题。   

4.促肿瘤的中性粒细胞是通过哪些机制产生作用的？   

4.1促进肿瘤发展   

在DEN诱导的HCC小鼠中，中性粒细胞是肿瘤发展所必需的，因为选择性中性粒细胞耗竭降低了它们的HCC负担。在该模型中，中性粒细胞在肝脏中积聚并通过ROS介导的对端粒DNA的损伤促进肿瘤发生。中性粒细胞衍生的ROS也促进上皮细胞衰老，这可促进HCC的发展。中性粒细胞似乎对stelic动物模型(STAM)中的HCC发展至关重要。

STAM鼠是一种由单剂量链脲佐菌素和高脂肪饮食引发的非酒精性脂肪性肝炎模型。在STAM小鼠中，推测高水平的游离脂肪酸可能会刺激NET的产生，这似乎对HCC的发病机制至关重要，因为DNaseI对NET的抑制大大减少了炎症和随后的肿瘤发展。在多种非酒精性脂肪性肝炎模型中进行的进一步研究表明，NETs通过TLR4信号传导在促进调节性T(Treg)细胞的分化和扩增中发挥作用，从而创造了一个允许HCC发展的免疫抑制环境。在HCC的斑马鱼模型中，在诱导krasV12表达后观察到中性粒细胞快速浸润到肝脏中，这会产生炎症环境。与其他HCC模型一样，该模型中的中性粒细胞耗竭可改善肿瘤发生。尽管这些是临床前研究，但这些发现可能与人类HCC相关，因为人类HCC通常是在慢性肝脏炎症的背景下发展的，并且中性粒细胞占炎症浸润的很大一部分。中性粒细胞在HCC发展中的作用总结在图2中。  

图2.中性粒细胞驱动的肝细胞癌促肿瘤机制   

4.2促进局部肿瘤进展  

中性粒细胞通过多种机制促进HCC进展，包括抑制抗肿瘤免疫反应、直接增强肿瘤细胞生长和侵袭性以及促进细胞外基质重塑和血管生成（图2）。

中性粒细胞主要通过其对T细胞的抑制作用来抑制抗肿瘤免疫反应。HCC肿瘤中的TAN表达PD1的配体PDL1，并通过PDL1与PD1结合抑制CD4+和CD8+T细胞的功能。T细胞检查点受体PD1与T细胞的结合直接抑制T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒活性，并刺激Treg细胞扩增。中性粒细胞也通过精氨酸酶1、iNOS和ROS46的作用抑制CD4+和CD8+T细胞。精氨酸酶1耗尽L‑精氨酸，这是T细胞增殖所需的一种关键代谢物。iNOS催化一氧化氮的产生，一氧化氮抑制T细胞增殖并诱导其凋亡，中性粒细胞产生的ROS抑制T细胞活化。

此外，TAN诱导CD4+T细胞表达促肿瘤细胞因子IL‑10和TGFβ，同时抑制细胞毒性CD8+T细胞。IL‑10还通过抑制抗原呈递和炎性细胞因子的产生间接抑制CD4+T细胞功能以及直接抑制CD4+T细胞增殖。TGFβ还促进Treg细胞分化和T细胞衰竭。TAN还可以通过分泌CCL2和CCL17募集免疫抑制性巨噬细胞和Treg细胞，这与对索拉非尼的耐药性有关。我们注意到中性粒细胞耗竭改善了临床前HCC模型中对索拉非尼的反应。HCC相关的中性粒细胞还通过精氨酸酶1、iNOS和ROS活性以及通过NKp30和膜结合TGFβ1的参与来抑制NK细胞功能。中性粒细胞可以通过降低自身CD86和主要组织相容性复合物II类(MHC‑II)的表达以及增加库普弗细胞PDL1的表达，来抑制库普弗细胞抗原呈递功能。

中性粒细胞还可能通过促进HCC细胞中的干细胞样表型来影响早期肿瘤进展。干细胞样癌细胞是HCC疾病进展和治疗耐药性的关键驱动因素。TANs通过释放骨形态发生蛋白2和TGFβ诱导HCC干细胞样细胞特征。一旦出现干细胞样特征，可能会建立一个强化的正反馈回路，从而通过CXCL5募集更多的中性粒细胞。同样，中性粒细胞产生IL‑6和HGF，它们会促进干细胞样特征和增殖。中性粒细胞通过释放MMP9进一步促进HCC进展，MMP9会刺激细胞外基质重塑、血管生成和潜伏TGFβ30的激活。肿瘤周围和肿瘤内的中性粒细胞在HCC中可能具有不同的功能，这可能解释了它们预后相关性的差异。例如，瘤周中性粒细胞是HGF和MMP9的主要来源，这表明它们参与了肿瘤边缘的血管生成、细胞外基质重塑和肿瘤侵袭。NETs在HCC肿瘤微环境中的作用尚不清楚；然而，来自其他癌症的新证据表明，NETs在肿瘤微环境中保护肿瘤细胞免受NK细胞和T细胞的细胞毒性，从而推动肿瘤进展。

4.3促进肿瘤转移  

TANs还促进肿瘤转移（图2）。在HCC的植入模型中，注射中性粒细胞会增加转移，而中性粒细胞耗竭会减少转移。在HCC患者中，肿瘤周围中性粒细胞的数量与转移的存在相关并且循环中性粒细胞的添加增加了体外HCC细胞的迁移和侵袭能力。中性粒细胞可直接通过NET的释放和HGF、ROS、制瘤素M和MMP9的分泌增强HCC细胞的转移表型。与非HCC患者相比，来自HCC患者的中性粒细胞显示出更多的NET形成，并且与没有转移的HCC相比，在已转移的HCC中发现了更多的NET。NETs在HCC转移中的作用的直接证据显示在转移性HCC模型中，其中Hepa1‑6细胞被注射到免疫活性小鼠的尾静脉或脾脏中。

在该模型中，DNase介导的NET抑制降低了肝和肺转移的负担。HCC细胞可以内化NET材料，从而激活TLR信号并诱导细胞存活率增加和刺激更具侵袭性的表型。此外，TAN是HGF的来源，它通过MET激活增强HCC细胞的转移能力。中性粒细胞衍生的ROS也增加了HCC细胞的转移能力。ROS在TGFβ1存在下通过p38MAPK激活诱导HCC细胞上β3整合素的在细胞表面表达。当注射到免疫缺陷小鼠中时，这些β3整合素阳性细胞具有增加的侵袭能力和增强的转移。中性粒细胞衍生的MMP9和制瘤素M通过增加血管生成、促进肿瘤细胞迁移和TGFβ活化来促进局部疾病进展和转移。

5. 中性粒细胞在肿瘤免疫治疗中的潜在作用  

临床前工作强调了中性粒细胞靶向治疗在HCC小鼠模型中的潜在益处，证明中性粒细胞耗竭可有效减少肿瘤负担和改善对全身治疗的治疗反应。然而，由于存在与中性粒细胞减少症相关的严重感染风险，HCC患者不宜进行全中性粒细胞耗竭。HCC患者对传统的细胞毒性化疗药物（通常也会导致中性粒细胞减少）耐受性较差，这些患者通常患有肝硬化和门静脉高压症。考虑到这一点，目前正在研究的大多数中性粒细胞靶向疗法都针对特定的中性粒细胞功能，例如肿瘤募集或对中性粒细胞表型进行操纵。

尽管大多数研究指出中性粒细胞在HCC中具有促肿瘤作用，但中性粒细胞也具有抗肿瘤潜力。例如，中性粒细胞衍生的ROS（如过氧化氢和一氧化氮）对癌细胞具有细胞毒性，早期肺癌中的中性粒细胞获得与刺激T细胞反应能力相关的抗原呈递特征相关。尽管迄今为止没有实验证据表明中性粒细胞在HCC中具有抗肿瘤作用，但进一步了解中性粒细胞在癌症中的可塑性和功能范围可能会产生可以通过控制中性粒细胞从促肿瘤转化为抗肿瘤表型的策略。

与药物发现中的常见情况一样，本综述中讨论了许多中性粒细胞调节疗法，这些方法最初是为其他适应症而开发的，并且具有中性粒细胞以外的作用。此外，传统的HCC疗法也可能通过中性粒细胞发挥一些作用。图3总结了正在开发的调节中性粒细胞的疗法。在HCC和其他癌症中的使用的调查中性粒细胞调节疗法的临床试验分别列于表2和补充表1中。

图3.可能的中性粒细胞靶向治疗肝细胞癌的靶点  

表2.中性粒细胞靶向治疗肝癌的临床试验  

补充表1. 临床试验中除肝细胞癌以外的癌症的中性粒细胞疗法   

5.1常规疗法   

索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，直到最近它还是晚期HCC的一线全身治疗。索拉非尼的主要作用机制是抑制VEGF，从而减少肿瘤血管生成。有趣的是，肝切除前接受索拉非尼治疗的患者比未接受索拉非尼治疗的患者有更多的TAN（一种不良预后因素）。抑制肿瘤血管生成可能会诱导缺氧，从而促进中性粒细胞募集和极化为促肿瘤表型，从而推动疾病进展和恶化预后。在前临床模型中，索拉非尼联合中性粒细胞耗竭具有协同抗癌作用。在结直肠癌模型中，贝伐单抗（也抑制血管生成）对中性粒细胞有类似的作用。

因此，抗血管生成剂和中性粒细胞调节疗法的组合可能需要进一步研究来作为HCC的未来治疗方法。此外，多激酶抑制剂乐伐替尼可减少TGFβ信号传导，并且在HCC临床前模型中与抗PD1疗法联合使用时，可激活肿瘤微环境中的免疫反应，从而改善治疗反应。但是，这种乐伐替尼诱导的TGFβ信号传导减少对中性粒细胞的影响尚待研究。   选择性内放疗和立体定向消融放疗用于治疗局部晚期HCC。放疗可能通过中性粒细胞发挥其在HCC中的一些抗肿瘤作用。例如，放射疗法通过中性粒细胞衍生的ROS，以及潜在地调节中性粒细胞的数量和功能诱导无菌炎症和杀死HCC细胞。

在小鼠不同部位皮下接种不同癌细胞系的HCC异位模型表明，在同一动物的一个肿瘤部位照射可以在同一动物的未照射肿瘤部位发挥强大的抗肿瘤作用。这种效应是由肿瘤内中性粒细胞和全身性促肿瘤中性粒细胞减少以及IL‑6和G‑CSF164的全身水平降低所介导的。放疗对人类HCC中性粒细胞表型的影响值得进一步研究。   

5.2趋化因子抑制剂   

趋化因子受体CXCR2是中性粒细胞定向治疗最有希望的靶点一。CXCR2对CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5和IL‑8具有高亲和力，它们都参与HCC肿瘤的中性粒细胞募集。观察到TAN对T细胞具有免疫抑制作用，并且它们的存在预示着免疫检查点抑制剂治疗的失败，这导致研究调查了CXCR2抑制与T细胞免疫检查点抑制剂。随着这种方法在临床前研究中取得成功，小鼠中CXCR2的基因缺失和AZD5069对CXCR2的药理学抑制都与胰腺肿瘤免疫景观的深刻变化有关。这种药物组合在转移性胰腺导管腺癌患者的Ib‑II期开放标签试验中进行了研究，结果表明AZD5069治疗增加了效应T细胞向胰腺导管腺癌的浸润，并与一种新的对免疫检查点抑制剂的敏感性有关，减少了转移并延长治疗患者的生存期。

然而，CXCR2的抑制作用尚未在HCC中进行研究。CXCR6及其配体CXCL16通过上调VEGF和中性粒细胞募集促进HCC进展。具有口服生物利用度能力的CXCR6拮抗剂已在HCC173的异种移植模型中显示出抗肿瘤功效，尽管CXCR6拮抗剂尚未进入临床试验。CCL5是一种由HCC细胞表达的趋化因子，它通过与CCR5受体结合来募集中性粒细胞。

HCC和其他癌症的临床前研究表明，CCR5的药理学阻断或CCR5的基因缺失可减少肿瘤对中性粒细胞的募集并延长生存期，但CCR5抑制尚未在HCC患者中进行测试。CXCR4及其配体CXCL12可以影响HCC中肿瘤中性粒细胞的募集。临床前研究表明CXCR4抑制与索拉非尼和/或抗PD1治疗的协同作用。CXCR4抑制剂尚未进入HCC的临床试验，但这种方法已在胰腺导管腺癌、卵巢癌和结直肠癌的I期试验中显示出疗效迹象。   

5.3细胞因子抑制剂   

肿瘤内的细胞因子具有许多功能，包括使中性粒细胞极化为促肿瘤表型。直接抑制这些途径可以将中性粒细胞从促肿瘤转变为抗肿瘤表型是一种有潜力的治疗策略。   IL‑6参与促肿瘤中性粒细胞的募集和极化，并可以通过信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号上调免疫检查点。在HCC的异种主题模型中，IL‑6和PDL1的同时阻断协同作用以减少肿瘤负荷并提高生存率。淫羊藿苷是一种源自淫羊藿（用于中药）的小分子，由于其对IL‑6‑JAK2‑STAT3通路的作用，而具有中性粒细胞调节和免疫调节作用。淫羊藿苷在HCC患者中的I期和II期试验已证明具有良好的安全性和疗效迹象。   

TGFβ驱动中性粒细胞极化为促肿瘤表型。Ib期和II期galunisertib（一种选择性TGFR1抑制剂）与索拉非尼联合用于HCC患者的试验证明了良好的安全性和一些疗效证据：肿瘤进展的中位时间为4.1个月，总生存期为18.8个月。正在等待更大规模的安慰剂对照试验。   其他还有中性粒细胞分化调节剂、5型磷酸二酯酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、STAT3抑制剂、CD47–SIRPα检查点抑制剂、TRAILR2激动剂、S100A9抑制剂、等其他中性粒细胞表型调节剂。   

6.未来发展领域   

6.1当前治疗策略有局限   

尽管在临床前研究中有有前景的发现，但中性粒细胞靶向疗法还是有重要的局限性。正如在中性粒细胞耗竭的小鼠模型中所证明的那样，由于代偿机制，中性粒细胞的恢复通常很快。临床前数据表明，在头颈癌模型中停止CXCR2抑制后仅几天，肿瘤内TAN的数量就会反弹。目前的方法进一步受到对促肿瘤中性粒细胞特异性有限的阻碍。例如，阻断中性粒细胞趋化因子受体也可以影响抗肿瘤中性粒细胞以及其他白细胞的募集和功能。对TAN表型的更深入了解，以及对中性粒细胞亚群的进一步定义有望识别独特的标志物和功能，从而实现更精细的HCC中性粒细胞治疗调节策略。   

6.2临床前模型需要改善   

由于中性粒细胞的寿命短，大多数机制研究严重依赖于HCC的小鼠模型。大多数HCC研究使用DEN诱导的化学毒性模型或（原位或异位）植入模型。DEN模型已建立良好，但缺点是肿瘤发展时间长，并且取决于所用小鼠的品系和性别的变异性。此外，DEN肿瘤的突变很难代表人类HCC的突变。植入模型可以快速建立和询问，这使得它们成为测试治疗剂的理想选择，但它们在概括潜在肝病或原位HCC肿瘤原位慢性发展方面受到限制。通常皮下注射癌细胞系的异位模型无法模拟HCC肿瘤微环境，然而将癌细胞系注射到健康肝脏中的原位模型需要成像或手术专业知识。此外，除非使用同源癌细胞，否则就需要免疫功能低下的小鼠来预防免疫排斥，结果这些模型无法概括完整的免疫微环境。

在为了确定中性粒细胞在HCC中的作用的研究中，应避免使用免疫功能低下的小鼠模型。   人源化模型能够将人类HCC植入具有人类免疫系统的小鼠体内，从而改善HCC免疫环境的近似值。人源化模型的主要缺点是需要人类胎儿或脐带血来重建免疫系统，而这些模型目前不支持功能齐全的免疫系统。例如，由于缺乏各种刺激因子和正常淋巴组织发育，许多人源化模型不支持正常骨髓谱系发育或适当体液免疫反应的发展。

此外，动物的其余部分没有人源化，这意味着肝脏和其他器官仍然是小鼠来源的。   大多数关于中性粒细胞在HCC中的体内作用的研究都使用了中性粒细胞耗竭模型，这些模型通常使用抗Gr1和/或抗Ly6G抗体产生。尽管抗Gr1抗体在中性粒细胞消耗方面非常有效，但这种抗体同时靶向Ly6G和Ly6C，因此也会消耗单核细胞和巨噬细胞。抗Ly6G抗体对中性粒细胞具有特异性，但会提供不完全的中性粒细胞耗竭，尤其是在肝脏和老年小鼠中，因为从骨髓新释放的循环中性粒细胞的Ly6G细胞表面表达不足。这种障碍可以通过使用双抗体耗竭方法部分克服，其中除了抗Ly6G外，还施用抗Ly6G抗体，以通过补体激活刺激快速耗竭（与Fc调理作用相反，后者较慢）。

基于抗体的消耗方法的另一个限制是它们的治疗效果持续时间短，并且由于代偿性粒细胞生成，中性粒细胞数量迅速反弹。目前，缺乏有效的消耗特定中性粒细胞亚群（N1、N2或PMN‑MDSC）的方法的部分原因是缺乏充分表征的人群特异性标志物。未来，基于单细胞技术的研究可能会为这些群体使用从而确定特定标记，这些标记可用于在基因或治疗上消耗它们。   在设计检验嗜中性粒细胞在HCC中的作用的实验时，必须仔细考虑特定模型的特定限制。理想情况下，在一个模型中获得的结果应该在另一个模型中得到验证。最重要的是，小鼠模型的发现需要与人类HCC的结果相关联。随着人源化模型进一步完善并能够维持更完整的免疫系统，应优先考虑使用这些模型，因为它们具有最接近人类HCC的能力。   

6.3慢性肝病中的中性粒细胞   

鉴于HCC是在不同病因的慢性肝病的背景下发展起来的，多种疾病过程正在进行中。例如，患有糖尿病和非酒精性脂肪肝的患者发展为HCC，至少有三个并发的疾病过程，这些过程都可能影响中性粒细胞表型和功能。因此，在HCC中观察到的中性粒细胞表型和功能的一些变化可能是由慢性肝病而不是HCC驱动的。我们对慢性肝病和HCC如何相互作用以影响中性粒细胞功能的理解，被大多数HCC的临床前模型不能复制慢性肝病的事实进一步混淆。中性粒细胞在慢性肝病中的作用远未完全阐述，但目前的研究表明（如在HCC中）它们具有一系列表型和功能，要么通过髓过氧化物酶、ROS和NET产生驱动炎症和疾病进展，要么通过HGF释放和胶原蛋白降解有助于疾病消退。这种异质性证明了在进行机制研究时结合使用HCC和慢性肝病的临床前模型、以及在研究中性粒细胞在人类HCC中的作用时将患有慢性肝病的患者作为对照组的重要性。   

6.4其他发展领域   

肿瘤微环境中更广谱的免疫细胞对中性粒细胞表型的影响尚未在HCC中进行探索，但也值得研究。例如，在其他癌症中，NK细胞可以根据背景将中性粒细胞调节为促肿瘤或抗肿瘤表型。此外，了解整个免疫组库（包括中性粒细胞）如何与HCC患者中的肠道和肿瘤微生物组相互作用可能对有效治疗至关重要，因为在其他癌症中的研究表明这些是重要因素。    

“论肿道麻”述评

越来越多的证据表明，中性粒细胞在HCC的发病机制中发挥重要作用，参与了肿瘤发生、局部肿瘤进展和转移。中性粒细胞促进HCC的主要机制：

（1）抑制抗癌免疫。

（2）通过刺激血管生成和降解细胞外基质直接增强肿瘤细胞的存活、侵袭和转移能力。

中性粒细胞在癌症中表现出多种功能和表型，其表型动态和可塑性变化对肿瘤患者成功应用免疫疗法至关重要。多种中性粒细胞调节疗法正在进入治疗HCC和其他癌症的临床试验。然而，需要进一步的工作来确定中性粒细胞表型，尤其是TAN表型在HCC中的作用。需要改进出能准确代表HCC肿瘤微环境的实验模型，以及我们需要对慢性肝病中中性粒细胞表型有更多了解。总之，中性粒细胞是肿瘤发生发展的参与者，随着研究的深入，中性粒细胞及其相关因子有望成为肿瘤治疗的新手段。